Tuotteet
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR-tunnistussarja 2019-nCoV:lle
Odotettu käyttö
Tätä sarjaa käytetään uuden koronaviruksen (2019-nCoV) laadulliseen havaitsemiseen käyttämällä kurkun vanupuikkoja, nenänielun vanupuikkoja, bronkoalveolaarista huuhtelunestettä ja ysköstä. Tämän tuotteen tunnistustulos on vain kliininen vertailu, eikä sitä tule käyttää ainoana näyttöä kliinisestä diagnoosista ja hoidosta. Suositellaan kattavaa tilan analyysiä yhdessä potilaan kliinisten oireiden ja muiden laboratoriotutkimusten kanssa.
Tarkastusperiaate
Sarja perustuu yksivaiheiseen RT-PCR-tekniikkaan.Itse asiassa vuoden 2019 uudet koronaviruksen (2019-nCoV) ORF1ab- ja N-geenit valittiin monistumisen kohdealueiksi.Spesifiset alukkeet ja fluoresoivat koettimet (N-geenikoettimet on leimattu FAM:lla ja ORF1ab-koettimet on merkitty HEX:llä) on suunniteltu havaitsemaan vuoden 2019 uuden tyypin koronaviruksen RNA näytteistä.Pakkaus sisältää myös endogeenisen sisäisen kontrollin havaitsemisjärjestelmän (sisäinen kontrolligeenikoetin, joka on leimattu CY5:llä) näytteenottoprosessin, RNA:n ja PCR-monistuksen seuraamiseksi, mikä vähentää vääriä negatiivisia tuloksia.
Pääkomponentit
| Komponentit | Äänenvoimakkuus（48T/sarja） |
| RT-PCR-reaktioliuos | 96 µl |
| nCOV-alukkeen TaqMan-koetinseos (ORF1ab, N-geeni, RnaseP-geeni) | 864 µl |
| Negatiivinen kontrolli | 1500 µl |
| nCOV-positiivinen kontrolli (l ORF1ab N-geeni) | 1500 µl |
Omat reagenssit: RNA:n uutto- tai puhdistusreagenssit.Negatiivinen/positiivinen kontrolli: Positiivinen kontrolli on RNA:ta, joka sisältää kohdefragmentin, kun taas negatiivinen kontrolli on nukleiinihappovapaata vettä.Käytön aikana niiden tulee osallistua uuttamiseen ja niitä tulee pitää tarttuvina.Niitä tulee käsitellä ja hävittää asiaankuuluvien määräysten mukaisesti.
Sisäinen vertailugeeni on ihmisen RnaseP-geeni.
Varastointiolosuhteet ja viimeinen käyttöpäivä
-20±5 ℃, vältä toistuvaa pakastusta ja sulattamista yli 5 kertaa, voimassa 6 kuukautta.
Soveltuva instrumentti
FAM / HEX / CY5 ja muut monikanavaiset fluoresoiva PCR-laitteet.
Näytevaatimukset
1.Soveltuvat näytetyypit: nielun vanupuikko, nenänielun vanupuikko, bronkoalveolaarinen huuhteluneste, yskös.
2. Näytteenotto (aseptinen tekniikka)
Nielupuikko: Pyyhi nielurisat ja nielun takaseinä kahdella vanupuikolla samanaikaisesti ja upota vanupuikko sitten koeputkeen, joka sisältää näyteliuoksen
Yskös: Kun potilaalla on syvä yskä, kerää yskitty yskös kierrekorkiseen koeputkeen, joka sisältää näyteliuoksen;Bronkoalveolaarinen huuhteluneste: Lääketieteen ammattilaisten suorittama näytteenotto.3.Näytteiden varastointi ja kuljetus
Näytteet viruseristystä ja RNA-testausta varten tulee testata mahdollisimman pian.Näytteet, jotka voidaan havaita 24 tunnin sisällä, voidaan säilyttää 4 ℃:ssa;joita ei voida havaita 24:n sisällä
tuntia tulee säilyttää -70 ℃ tai sen alapuolella (jos varastointiolosuhteet eivät ole -70 ℃, ne tulee säilyttää
säilytetty väliaikaisesti -20 ℃ jääkaapissa).Näytteiden toistuvaa jäätymistä ja sulattamista tulee välttää kuljetuksen aikana.Näytteet tulee lähettää laboratorioon mahdollisimman pian keräämisen jälkeen.Jos näytteitä on kuljetettava pitkiä matkoja, suositellaan säilytystä kuivajäässä.
Testausmenetelmät
1 Näytteen käsittely ja RNA:n erottaminen (näytteenkäsittelyalue)
On suositeltavaa ottaa 200 μl nestemäistä näytettä RNA:n uuttamista varten.Katso asiaan liittyvät uuttovaiheet kaupallisten RNA-uuttopakkausten ohjeista.Sekä negatiivista että negatiivista
tämän sarjan kontrollit osallistuivat uuttamiseen.
2 PCR-reagenssin valmistelu (reagenssin valmistusalue)
2.1 Poista kaikki osat sarjasta ja sulata ja sekoita huoneenlämmössä.Sentrifugoi 8 000 rpm muutaman sekunnin ajan ennen käyttöä;laske tarvittava määrä reagensseja ja reaktiojärjestelmä valmistetaan seuraavan taulukon mukaisesti:
| Komponentit | N-annos (25 µl järjestelmä) |
| nCOV-aluke TaqMan-koetinseos | 18 µl × N |
| RT-PCR-reaktioliuos | 2 µl × N |
| *N = testattujen näytteiden lukumäärä + 1 (negatiivinen kontrolli) + 1 (nCOVpositiivinen kontrolli) | |
2.2 Kun komponentit on sekoitettu perusteellisesti, sentrifugoi lyhyen aikaa, jotta kaikki putken seinämän neste putoaa putken pohjalle, ja jaa sitten 20 µl:n amplifikaatiojärjestelmä PCR-putkeen.
3 Näytteenotto (näytteen valmistusalue)
Lisää 5 μl negatiivista ja positiivista kontrollia uuttamisen jälkeen.Testattavan näytteen RNA lisätään PCR-reaktioputkeen.
Sulje putki tiukasti ja sentrifugoi 8 000 rpm muutaman sekunnin ajan ennen kuin siirrät sen amplifikaatiohavaitsemisalueelle.
4 PCR-monistus (monistettu havaitsemisalue)
4.1 Aseta reaktioputki instrumentin näytekennoon ja aseta parametrit seuraavasti:
| vaiheessa | Kierrä määrä | Lämpötila(°C) | Aika | kokoelmasivusto |
| Käänteinentranskriptio | 1 | 42 | 10 min | - |
| Esidenaturaation | 1 | 95 | 1 minuutti | - |
| Kierrä | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | tiedonkeruu |
Instrumentin tunnistuskanavan valinta: Valitse fluoresenssisignaalille FAM、HEX、CY5-kanava.Älä valitse ROX-vaihtoehtoa viitefluoresoivalle NONE-tuotteelle.
5 Tulosanalyysi (Katso kunkin instrumentin kokeellinen ohjeet asettamista varten)
Tallenna tulokset reaktion jälkeen.Säädä analyysin jälkeen perusviivan aloitusarvoa, loppuarvoa ja kynnysarvoa kuvan mukaan (käyttäjä voi säätää todellisen tilanteen mukaan, aloitusarvoksi voidaan asettaa 3~15, loppuarvoksi 5~20, säätö) logaritmisessa kaaviossa Ikkunan kynnysarvossa kynnysviiva on logaritmisessa vaiheessa ja negatiivisen kontrollin vahvistuskäyrä on suora tai kynnysviivan alapuolella).
6 Laatutarkistus (testissä on prosessiohjaus) Negatiivinen kontrolli: Ei ilmeistä vahvistuskäyrää FAM-, HEX-, CY5-tunnistuskanaville
COV-positiivinen kontrolli: FAM- ja HEX-tunnistuskanavien ilmeinen vahvistuskäyrä, Ct-arvo ≤32, mutta ei CY5-kanavan vahvistuskäyrää;
Yllä olevat vaatimukset on täytettävä samanaikaisesti samassa kokeessa;Muuten kokeilu on virheellinen ja se on toistettava.
7 Tulosten määrittäminen.
7.1 Jos testinäytteen FAM- ja HEX-kanavissa ei ole vahvistuskäyrää tai Ct-arvo > 40 ja CY5-kanavassa on vahvistuskäyrä, voidaan päätellä, että vuoden 2019 uutta koronavirusta (2019-nCoV) ei ole RNA näytteessä;
.2 Jos testinäytteessä on selvät vahvistuskäyrät FAM- ja HEX-kanavissa ja Ct-arvo on ≤40, voidaan päätellä, että näyte on positiivinen vuoden 2019 uudelle koronavirukselle (2019-nCoV).
7.3 Jos testinäytteellä on selkeä vahvistuskäyrä vain yhdessä FAM- tai HEX-kanavassa ja Ct-arvo on ≤40 ja toisessa kanavassa ei ole vahvistuskäyrää, tulokset on testattava uudelleen.Jos uusintatestien tulokset ovat johdonmukaisia, näytteen voidaan katsoa olevan positiivinen uuden suhteen
koronavirus 2019 (2019-nCoV).Jos uusintatestitulos on negatiivinen, voidaan katsoa, että näyte on negatiivinen vuoden 2019 uudelle koronavirukselle (2019-nCoV).
Positiivinen arviointiarvo
ROC-käyrämenetelmää käytetään sarjan CT-viitearvon määrittämiseen ja sisäisen ohjauksen viitearvo on 40.
Testitulosten tulkinta
1.Jokainen koe tulee testata negatiivisten ja positiivisten kontrollien varalta.Testitulokset voidaan määrittää vain, kun kontrollit täyttävät laadunvalvontavaatimukset
2.Kun FAM- ja HEX-tunnistuskanavat ovat positiivisia, CY5-kanavan (sisäinen ohjauskanava) tulos voi olla negatiivinen järjestelmäkilpailun vuoksi.
3.Kun sisäisen kontrollin tulos on negatiivinen, jos myös koeputken FAM- ja HEX-tunnistuskanavat ovat negatiivisia, se tarkoittaa, että järjestelmä on poistettu käytöstä tai toiminta on väärä, t testi on virheellinen.Siksi näytteet on testattava uudelleen.
